CETOCOEN
Projekt vybudování Centra pro výzkum toxických látek v prostředí
Centrum pro výzkum
toxických látek v prostředí
Kamenice 753/5, pavilon A29
625 00 Brno
www.recetox.muni.cz

Průběh Výzkumného programu 3

Průběh výzkumného programu k 03/2011


Enzymy jsou široce používány pro syntézu léčiv, agrochemikálií a potravinářských aditiv, protože jejich schopné katalyzovat enantioselektivní transformace. Pochopení molekulární podstaty enzym-substrátových interakcí, které přispívají k enantioselektivitě, je důležité pro konstrukci selektivních enzymů metodami proteinového inženýrství. Doposud byl kladen důraz na reakce katalyzované enzymy lipásami, esterásami, lyásami, aminotransferásami a ketoreduktasami. V našem projektu jsme se zaměřili na kinetické rozlišení α-bromoesterů a β-bromoalkanů novou skupinou enzymů – halogenalkan dehalogenasami (Tabulka 1).

Pozornost byla věnována konstrukci enantioselektivních halogenalkan dehalogenas pro biokatalýzu, a výsledky byly úspěšně publikovány v renomovaném odborném časopise (Prokop Z., Sato Y., Brezovský J., Mozga T., Chaloupková R., Koudeláková T., Jeřábek P., Štěpánková V., Natsume R., Leeuwen J. G. E., Janssen D. B., Florián J., Nagata Y., Senda T. and Damborský J., 2010: Enantioselectivity of Haloalkane Dehalogenases and its Modulation by Surface Loop Engineering. Angewandte Chemie International Edition 49: 6111-6115). Studovali jsme strukturní podstatu enantioselektivity halogenalkan dehalogenas s využitím enzymové kinetiky, proteinové krystalografie, místně-cílené mutageneze, termodynamické analýzy a počítačového modelování. Prokázali jsme, že modifikace povrchové smyčky halogenalkan dehalogenas ovlivňuje jejich enantiodiskriminativní chování. Teplotní závislost enantioselektivity u α-bromoalkanů je po odstranění smyčky převrácená, při vložení dodatečné bodové mutace se závislost selektivity navrátí zpět (Obrázek 1). Toto chování nebylo pozorováno s βbromoestery a dokládá rozdílnou strukturní podstatu enantiodiskriminace těchto dvou skupin substrátů.

V rámci studie vztahů mezi strukturou a funkcí a jejího vlivu na enantioselektivitu halogenalkan dehalogenas byla mutagenezí zkonstruována nová varianta DbeA enzymu z bakterie Bradyrhizobium elkani USDA94, do které byla vložena unikátní sekvence z enzymu DbjA. Byl vyvinut protokol ke krystalizaci nové varianty DbeA a provedeny rentgeno-strukturní analýzy komplexů této enzymové varianty s 1-fluorpentanem a 1,3-dichlorpropanem (Prudníková T., Chaloupková R., Sato Y., Nagata Y., Degtjarik O., Kuty M., Řezáčová P., Damborský J. and Kuta Smatanová, I., 2011: Development of a Crystallization Protocol for the DbeA1 Variant of Novel Haloalkane Dehalogenase from Bradyrhizobium elkani USDA94. Crystal Growth & Design 11: 516-519).

Pro poznání strukturně-funkční podstaty katalytického účinku halogenalkandehalogenas byla realizována krystalografická analýza komplexů DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064 s 2-propanolem a 1,2,3-trichloropropanem (TCP). Byla provedena strukturní analýza komplexu varianty DhaA013 s kumarinem, který bude využit ke zkoumání vlivu solventu na strukturní a funkční vlastnosti těchto enzymů (Stsiapanava A., Chaloupková R., Fořtová A., Brynda J., Weiss M. S., Damborský J. and Kuta Smatanová, I., 2011: Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of the Wild-Type Haloalkane Dehalogenase DhaA and its Variant DhaA13 Complexed with Different Ligands. Acta Crystallographica F67: 253-257).

K lepšímu pochopení strukturně-funkční podstaty dehalogenace environmentálního polutantu TCP byla provedena krystalografická analýza haloagenalkandehalogenasy DhaA31v komplexu s TCP (Lahoda M., Chaloupková R., Stsiapanava A., Damborský J. and Kuta Smatanová, I. 2011: Crystallization and crystallographic analysis of the Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064 DhaA mutant DhaA31 and its complex with 1,2,3-trichloropropane. Acta Crystalographica F67, 397–400).

Substrátová specifita je jednou z nejdůležitějších charakteristik enzymů. Byla provedena kvantitativní systematická analýza specifity devíti přírodních a čtyř konstruovaných halogenalkandehalogenáz pomocí vícerozměrné statistiky (Koudeláková T., Chovancová E., Brezovský J., Monincová M., Fořtová A., Jarkovský J. and Damborský J. 2011: Substrate specificity of haloalkane dehalogenases. Biochemical Journal (2011) 435, 00–00, v tisku). Analýza umožnila klasifikaci enzymů do 4 specifitních skupin a výběr "univerzálních" substrátů pro screening nových enzymů v přírodních zdrojích.

Tabulka 1. Enantioselektivita tří halogenalkan dehalogenas s vybranými α-bromoestery a β-bromoalkany.

Enantioselektivita tří halogenalkan dehalogenas s vybranými  α-bromoesterya β-bromoalkany.

Dvě strukturní podstaty enantioselektivity halogenalkan dehalogenas

Obrázek 1. Dvě strukturní podstaty enantioselektivity halogenalkan dehalogenas. a) termodynamická analýza reakce katalyzované DbjA (zelená), DbjA Δ(červená) a DbjA Δ+ His139Ala (černá) s 2-methyl bromobutyratem (vlevo) a 2-bromopentanem (vpravo) ukazuje teplotní závislost jejich enantiomerního poměru a entalpické-entropické kompenzace. b) Termodynamické parametry enantioselektivity DbjA, DbjA Δa DbjAΔ+ His139Ala: enantioselektivita (E), diferenciální přechod volné energie (ΔR-SΔG ‡ = ΔR-SΔH ‡ - T.ΔR-SΔS ‡) a jeho enthalpické ( ΔR-SΔH ‡) a entropické (T.ΔR-SΔS ‡) složky při teplotě T = 298 K. c) mutace mají výrazné účinky na aktivní místo, vazebné orientace a reaktivitu (R)-enantiomeru (černá) a ( S)-enantiomeru (červená). N a W na obrázku představují Asn38 a Trp104.


Průběh výzkumného programu k 06/2010


Vývoj biosenzorů a biokatalyzátorůStudována strukturní podstata enantioselektivity halogenalkan dehalogenáz s využitím enzymové kinetiky, proteinové krystalografie, místně-cílené mutageneze, termodynamické analýzy a počítačového modelování. Zaměření na kinetické rozlišení β-bromoesterů a β-bromoalkanů. Prokázáno, že modifikace povrchové smyčky halogenalkan dehalogenáz ovlivňuje jejich enantiodiskriminativní chování. Teplotní závislost enantioselektivity u β-bromoalkanů je po odstranění smyčky převrácená, při vložení dodatečné bodové mutace se závislost selektivity navrátí zpět. Toto chování nebylo pozorováno s α-bromoestery a dokládá rozdílnou strukturní podstatu enantiodiskriminace těchto dvou skupin substrátů.

Zpět